北航新闻网3月30日电（通讯员 杨贤达）腹壁疝气是临床外科中相对常见的疾病，常常导致进一步的并发症，如肠绞痛、肠梗阻或腹膜炎，严重时可能危及生命。在我国，腹壁疝气相关手术每年超过100万例，并呈上升趋势。目前，使用聚合物网片进行无张力疝气修复显著降低了疝气复发率和术后疼痛，然而常常引发免疫反应介导的并发症，如严重的异物反应、脏器粘连和纤维化，从而增加复发的风险。
北京航空航天大学生物与医学工程学院、国家医学攻关产教融合平台、生物力学与力学生物学教育部重点实验室、北京生物医学工程高精尖创新中心、高端医疗装备与器械工信部重点实验室樊瑜波教授团队开发了一种用于疝气聚合物网片纤维的杂合细胞膜涂层，能够有效平衡免疫反应与组织再生。该技术采用红细胞（RBCs）和血小板（PLTs）的细胞膜为原料，通过功能化脂质体和蚕丝蛋白层层自组装技术复合，利用点击化学共价结合到纤维表面。可点击脂质体与细胞膜的融合显著提高了涂层的涂覆效率、覆盖均匀性和体内稳定性。通过大鼠和小鼠皮下植入的组织学和流式细胞术分析表明，针对异物反应的不同细胞膜涂层具有显著的生物功能异质性。红细胞涂层更倾向于降低炎症与免疫抑制作用，血小板涂层更有利于材料与宿主整合促进损伤修复。二者杂合细胞膜涂层结合了各自优点，显著减轻了异物反应，促进了宿主细胞的浸润与M2型巨噬细胞的极化。重要的是，大鼠腹壁缺损修复的实验结果表明，杂合细胞膜涂层有效地防止了脏器粘连，促进了肌肉再生，增强了Pax7+/MyoD+肌肉卫星细胞的招募。研究结果表明，可点击的血液来源杂合细胞膜涂层为改善疝气网片在腹壁重建中的临床效果提供了一个有前景的方法。相关工作以“杂合血细胞膜涂层在腹壁重建中减轻异物反应、抗粘连和促再生效果”（“Hybrid cell membrane coating orchestrates foreign-body reactions, anti-adhesion, and pro-regeneration in abdominal wall reconstruction”）为题发表在《Biomaterials》。该论文通讯作者为樊瑜波教授与李林昊副教授，第一作者为杨铃冰博士（现为北京航空航天大学生物与医学工程学院讲师）与王浦博士（北京大学人民医院，疝和腹壁外科医师）。
图1.杂合细胞膜-丝素涂层的实验设计和目标
表面功能化纤维材料的制备过程包括三个步骤：从红细胞和血小板中提取细胞膜、将细胞膜与脂质体融合、以及将细胞膜涂层固定在纤维表面。首先，通过低渗溶血法和冷冻-解冻循环分别从大鼠全血中分离并提取红细胞和血小板。杂交膜通过聚碳酸酯膜微孔挤出制备。第二步，使用含有可点击功能基团的脂质体与细胞膜通过聚碳酸酯膜挤出，得到细胞膜-脂质体复合物。第三步是使用层层自组装（LbL）技术，利用蚕丝-叠氮化物涂层对电纺聚苯乙烯纤维支架、商业聚丙烯网片和丝编织网进行表面涂层，使纤维表面携带可点击的叠氮基团。最后，将细胞膜-脂质体复合物的悬液与叠氮-丝素涂层接触发生点击共价键合，固定并融合到纤维表面，最终形成细胞膜功能化涂层（图1）。
图2.通过脂质体融合提高细胞膜涂层的覆盖均匀性和涂层效率
细胞膜涂层的形成过程包括膜片段或囊泡的吸附、破裂和融合。然而，由于膜流动性的限制，相邻细胞膜的融合失败会导致涂层不均匀。在本研究中，为了提高涂层的覆盖均匀性，体系引入了脂质体来增强细胞膜的流动性。细胞膜片段和脂质体通过聚碳酸酯膜挤出，在此过程中，脂质体被插入到细胞膜中形成细胞膜-脂质体复合物。然后，这些复合物附着到电纺聚苯乙烯（PS）纤维表面，最终相互融合形成细胞膜涂层。实验结果表明，脂质体的加入不仅提高了细胞膜涂层的均匀性，还加速了细胞膜在纤维表面的吸附和融合。
图3.通过点击化学促进涂层体内稳定性
为了比较“物理吸附”与“化学点击”两种方法对细胞膜涂层在体内稳定性的影响，我们将通过这两种方法制备的细胞膜涂层植入小鼠皮下，并使用体内成像系统（IVIS）观察涂层的降解情况（图3）。在植入后的第4天，总体荧光强度显著下降。到第10天，“点击”组的剩余荧光强度为51.8%，而“吸附”组为38.7%。最后，“点击”组的剩余荧光强度为40.8%，荧光面积大小没有显著变化；而“吸附”组的剩余荧光强度为31.9%，荧光面积减少。与物理吸附相比，通过点击化学键合的细胞膜在体内的滞留时间更长（图3），说明点击化学介导的共价键合可以有效增强细胞膜涂层的稳定性。
图4.细胞膜涂层皮下植入后的异物反应组织学分析
组织切片定性结果（图4）表明，细胞膜涂层在减轻异物反应和增加宿主细胞浸润方面发挥了积极作用，尤其是具有红细胞膜和血小板膜协同效应的杂合膜。然而，不同的细胞膜对巨噬细胞极化和肌成纤维细胞形成有不同的影响，这可能是由于不同细胞膜的生物功能异质性所致。研究结果表明，红细胞膜表现出免疫抑制效应，而血小板膜则表现出一定的促炎效应，有利于免疫细胞的浸润。
图5.细胞膜涂层皮下植入的固有免疫细胞反应流式细胞术分析
植入体内的材料会首先触发固有免疫反应。固有免疫反应中的关键细胞参与者是中性粒细胞和不同亚型的巨噬细胞，它们在异物反应和组织修复中起着至关重要的作用。为了定量研究不同表面修饰电纺纤维对中性粒细胞招募和巨噬细胞表型的影响，我们不同涂层材料皮下植入C57BL/6J小鼠，并通过流式细胞术分析材料中髓系细胞群体特点（图5）。流式细胞术分析结果表明，膜涂层能有效减少Ly6C+炎症巨噬细胞的招募和聚集，降低M1型巨噬细胞的比例，增加M2型巨噬细胞的比例，其中血小板和杂合膜组表现出更明显的效果，从而缓解固有免疫反应中的前期炎症响应。
图6.细胞膜涂层聚丙烯网片在大鼠全层腹壁缺损模型中的脏器粘连和肌肉愈合情况
临床常见的商业聚丙烯（PP）网片，由于其疏水性表面，通常会导致脏器粘连和纤维化愈合。因此，本研究通过大鼠腹壁全层缺损模型评估了细胞膜涂层对PP网片的抗粘连和促再生作用。在第一周，细胞膜组则没有发现粘连。植入2周后，对照组与肠组织的粘连严重，形成了较大的粘连区域。肠组织在血小板组网片边缘处观察到粘连。植入4周后，所有组的粘连有所改善，但在对照组中仍然存在少量粘连。总体而言，红细胞膜组的抗粘连效果最为显著，而杂合组也表现出良好的抗粘连效果。结果表明，红细胞膜和红细胞膜涂层有不同的组织学反应。含红细胞膜的涂层能防止组织粘连，而含红细胞膜的涂层则能促进肌肉组织修复。
图7.细胞膜涂层在大鼠腹壁部分缺损模型中的肌肉干细胞招募
进一步统计同时表达Pax7和MyoD的肌肉卫星细胞数量。结果表明，与对照组相比，细胞膜功能化网片中Pax7+/MyoD+细胞的数量显著增加，尤其是在血小板膜组和杂合组中，观察到更多重叠的Pax7+/MyoD+细胞，且Pax7+/MyoD+细胞的数量显著高于红细胞组（图7）。这表明，以血小板膜为基础的涂层更有利于干细胞的招募和肌肉再生，而含红细胞的杂合涂层能够减少界面纤维化，促进网片与组织的整合。
团队认为研究中使用的血液衍生细胞膜涂层适合临床转化的原因如下：1.所有原材料均来源于血液衍生细胞和商业脂质体，与其他类型的细胞相比，这些原材料来源丰富且无需进行体外扩增或培养；2.本研究使用的点击化学反应不需要铜离子催化，整体处理过程主要是物理过程，涉及超声、挤出和摇动等方法，不添加有毒物质；3.整个涂层过程周期较短，整个过程可以在24小时内完成。因此，这种原料广泛、安全、稳定、反应迅速且无有害物质的生物活性涂层方法，适用于未来的临床转化研究。
该研究得到了国家自然科学基金(Nos. 32371405, T2288101, 12332019,与12425209)与北京市自然科学基金(L241030)的经费支持。
（审核：李德玉）
编辑：贾爱平
